Targeted massively parallel sequencing panel to diagnose genetic endocrine disorders in a tertiary hospital

Abstract Objectives To analyze the efficiency of a multigenic targeted massively parallel sequencing panel related to endocrine disorders for molecular diagnosis of patients assisted in a tertiary hospital involved in the training of medical faculty. Material and methods Retrospective analysis of the clinical diagnosis and genotype obtained from 272 patients in the Endocrine unit of a tertiary hospital was performed using a custom panel designed with 653 genes, most of them already associated with the phenotype (OMIM) and some candidate genes that englobes developmental, metabolic and adrenal diseases. The enriched DNA libraries were sequenced in NextSeq 500. Variants found were then classified according to ACMG/AMP criteria, with Varsome and InterVar. Results Three runs were performed; the mean coverage depth of the targeted regions in panel sequencing data was 249×, with at least 96.3% of the sequenced bases being covered more than 20-fold. The authors identified 66 LP/P variants (24%) and 27 VUS (10%). Considering the solved cases, 49 have developmental diseases, 12 have metabolic and 5 have adrenal diseases. Conclusion The application of a multigenic panel aids the training of medical faculty in an academic hospital by showing the picture of the molecular pathways behind each disorder. This may be particularly helpful in developmental disease cases. A precise genetic etiology provides an improvement in understanding the disease, guides decisions about prevention or treatment, and allows genetic counseling.

Growth hormone insensitivity with immune dysfunction caused by a STAT5B mutation in the south of Brazil: evidence for a founder effect

ABSTRACT Homozygous STAT5B mutations causing growth hormone insensitivity with immune dysfunction were described in 10 patients since 2003, including two Brazilian brothers from the south of Brazil. Our objectives were to evaluate the prevalence of their STAT5B mutation in this region and to analyze the presence of a founder effect. We obtained DNA samples from 1,205 local inhabitants, 48 relatives of the homozygous patients and four individuals of another affected family. Genotyping for STAT5B c.424_427del mutation and for two polymorphic markers around it was done through fragment analysis technique. We also determined Y-chromosome and mtDNA haplotypes and genomic ancestry in heterozygous carriers. We identified seven families with STAT5B c.424_427del mutation, with 33 heterozygous individuals. The minor allelic frequency of this mutation was 0.29% in this population (confidence interval 95% 0.08-0.5%), which is significantly higher than the frequency of other pathogenic STAT5B allele variants observed in public databases (p < 0.001). All heterozygous carriers had the same haplotype present in the homozygous patients, found in only 9.4% of non-carriers (p < 0.001), supporting the existence of a founder effect. The Y-chromosome haplotype, mtDNA and genomic ancestry analysis indicated a European origin of this mutation. Our results provide compelling evidence for a founder effect of STAT5B c.424_427del mutation.

Cryptic intragenic deletion of the SHOX gene in a family with Léri-Weill dyschondrosteosis detected by Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification (MLPA) / Deleção críptica intragênica do gene SHOX em uma família com discondrosteose de Léri-Weill detectada por Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification (MLPA)

LWD is associated to SHOX haploinsufficiency, in most cases, due to gene deletion. Generally FISH and microsatellite analysis are used to identify SHOX deletion. MLPA is a new method of detecting gene copy variation, allowing simultaneous analysis of several regions. Here we describe the presence of a SHOX intragenic deletion in a family with LWD, analyzed through different methodologies. Genomic DNA of 11 subjects from one family were studied by microsatellite analysis, direct sequencing and MLPA. FISH was performed in two affected individuals. Microsatellite analysis showed that all affected members shared the same haplotype suggesting the involvement of SHOX. MLPA detected an intragenic deletion involving exons IV-VIa, which was not detected by FISH and microsatellite analysis. In conclusion, the MLPA technique was proved to be the best solution on detecting this small deletion, it has the advantage of being less laborious also allowing the analysis of several regions simultaneously.

Discondrosteose de Léri-Weill (DLW) está associada à haploinsuficiência do gene SHOX resultante, principalmente, de deleções. Geralmente, o FISH e a análise de microssatélites são os métodos utilizados para a identificação destas deleções. MLPA é um novo método para detectar variações do número de cópias gênicas, permitindo uma análise simultânea de várias regiões. Aqui, descrevemos uma pequena deleção intragênica no SHOX em uma família com DLW analisada por diferentes metodologias. DNA genômico de 11 membros de uma família foram estudados por microssatélites, seqüenciamento direto e MLPA. FISH foi realizado em dois indivíduos afetados. Os microssatélites demonstraram que todos os membros afetados apresentavam o mesmo haplotipo, sugerindo o envolvimento do SHOX. MLPA identificou uma deleção intragênica envolvendo os éxons IV-VIa, que não foi detectada pelo FISH e pelos microssatélites. Conclui-se que o MLPA demonstrou melhor resolução para detectar esta pequena deleção, com a vantagem de ser menos trabalhoso e permitir a análise de várias regiões simultaneamente.

Baixa estatura por haploinsuficiência do gene SHOX: do diagnóstico ao tratamento / Short stature caused by SHOX gene haploinsufficiency: from diagnosis to treatment

Estudos realizados em pacientes portadores de deleções parciais dos cromossomos sexuais permitiram a caracterização do SHOX, gene localizado na região pseudoautossômica no braço curto dos cromossomos sexuais, fundamental na determinação da altura normal. A perda de uma cópia deste gene na síndrome de Turner (ST) explica dois terços da baixa estatura observada nesta síndrome. A haploinsuficiência do SHOX é detectada em 77 por cento dos pacientes com discondrosteose de Leri-Weill, uma forma comum de displasia esquelética de herança autossômica dominante e em 3 por cento das crianças com baixa estatura idiopática (BEI), tornando os defeitos neste gene a principal causa monogênica de baixa estatura. A medida da altura sentada em relação à altura total (Z da AS/AT para idade e sexo) é uma forma simples de identificar a desproporção corpórea e, associada ao exame cuidadoso do paciente e de outros membros da família, auxilia na seleção de pacientes para o estudo molecular do SHOX. O uso de hormônio de crescimento (GH) está bem estabelecido na ST e em razão da causa comum da baixa estatura com o de crianças com defeitos isolados do SHOX o tratamento destes pacientes com GH é também proposto. Neste artigo será revisado os aspectos clínicos, moleculares e terapêuticos da haploinsuficiência do SHOX.

Studies involving patients with short stature and partial deletion of sex chromosomes identified SHOX gene in the pseudoautosomal region of the X and Y chromosomes. SHOX haploinsufficiency is an important cause of short stature in a diversity of clinical conditions. It explains 2/3 of short stature observed in Turner syndrome (TS) patients. Heterozygous mutations in SHOX are observed in 77 percent of patients with Leri-Weill dyschondrosteosis, a common dominant inherited skeletal dysplasia and in 3 percent of children with idiopathic short stature, indicating that SHOX defects are the most frequent monogenetic cause of short stature. The sitting height/height ratio (SH/H) standard deviation score is a simple way to assess body proportions and together with a careful exam of other family members, effectively selected a group of patients that presented a high frequency of SHOX mutations. Growth hormone treatment of short stature due to TS is well established and considering the common etiology of short stature in patients with isolated defects of SHOX gene, this treatment is also proposed for these patients. Here, we review clinical, molecular and therapeutic aspects of SHOX haploinsufficiency.

Mieloma Múltiplo: 50 casos diagnosticados por citometria de fluxo / Multiple Myeloma: 50 cases diagnosed by flow cytometry

O Mieloma Mútiplo é uma doença de evolução heterogênea, na qual a maioria dos pacientes recai muito precocemente após o tratamento. Nesse contexto, o objetivo principal deste trabalho é relatar diferentes estratégias de análise do mieloma por citometria de fluxo e sua importância na associação com citogenética no diagnóstico de doença residual. Entre 2.450 casos de doenças onco-hematológicas estudados, de setembro de 1993 a agosto de 2004, foram diagnosticados 50 (2,0 por cento) Mieloma Múltiplo. Foram feitas análises morfológicas e, até o ano de 2000, as imunofenotipagens foram realizadas no citômetro de fluxo XL-MCL (Coulter) pela estratégia tamanho/complexidade, utilizando os anticorpos monoclonais CD19, CD20, CD38, CD45, CD56, HLA-DR, kappa e lambda de superfície e intracitoplasmáticas. A partir de 2001 passaram-se a utilizar painéis seqüenciais através do histograma CD138/Complexidade e anticorpos monoclonais CD19, CD38, CD56, CD117, kappa e lambda intracitoplasmáticas. Mais recentemente foram incluídos no painel os anticorpos CD45, HLA-DR e CD33. A análise do DNA foi realizada por citometria com auxílio do programa Multicycle em nove amostras, sendo que sete apresentaram população aneuplóide. O cariótipo com banda G foi realizado em 25 casos, e a pesquisa de deleção do 13q por FISH em 15. Alterações cromossômicas foram encontradas em 4 casos, sendo duas deleções de 13q confirmadas por FISH. A mudança na estratégia de gates associada à citogenética e ao estudo da cinética do ciclo do DNA permitem melhor identificação de células plasmáticas anômalas, avaliação do prognóstico e detecção de doença residual.